Charakterisierung und Unterscheidung von Bakterien

Der dänische Bakteriologe Hans Christian Gram (1853–1938)
Christof Goddemeier
Porträtfoto von Hans Christian Gram
Hans Christian Gram Studio portrait by Hansen & Weller, Royal Danish Library, gemeinfrei
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Mikroorganismen sind klein und durchsichtig. Die mikroskopische Darstellung von Bakterien erfordert eine 1.000-fache Vergrößerung.

Auch bei dieser Vergrößerung kann man sie nur sehen, wenn im Milliliter mehr als 104 bis 105 Keime vorhanden sind. Für die mikroskopische Be­trach­tung wird das Material auf einem Objektträger aufbereitet. Man unterscheidet Nativpräparate und gefärbte Präparate. Nativpräparate sind das Deckglaspräparat und der „hängende Tropfen“. Sie ermöglichen die Betrachtung lebender Bakterien, mit oder ohne Vitalfärbung. Vitalfarbstoffe, etwa Brillantkresylblau und Fluorescein, haben keine toxische Wirkung auf die Zelle und beeinträchtigen weder ihre Struktur noch ihre Funktion.

Lebende Bakterien weisen kaum Kontrast auf. Zur Erhöhung des Kontrasts dienen optische Methoden (Dunkelfeld- und Phasenkontrastmikroskopie) und ihre Anfärbung. Mittels der Färbung sind Bakterien auch im Hellfeld bei 1.000-facher Vergrößerung gut erkennbar. Im Unterschied zur Vitalfärbung werden die Bakterien dabei abgetötet. Nach Aufbringen auf einem Objektträger erfolgen zunächst Lufttrocknung und Fixierung durch Hitze oder Methylalkohol. Im Weiteren unterscheidet man Einfachfärbungen und Differenzialfärbungen. Bei der bekanntesten Einfachfärbung lässt man Methylenblau bis zu fünf Minuten einwirken und spült das Präparat dann mit Wasser. Die bekannteste Differenzialfärbung ist die Gram-Färbung. Der dänische Bakteriologe Hans Christian Gram hat sie 1884 erstmals beschrieben. Durch grampositive und gramnegative Bakterien verursachte Erkrankungen erfordern häufig eine unterschiedliche antibiotische Behandlung. Mittels der Gram-Färbung ist eine schnelle Unterscheidung möglich, und eine antibiotische Therapie kann sofort begonnen werden. Eine kulturelle An­züchtung des Erregers dauert demgegenüber mindestens 24 Stunden.

Lange galt die Miasmenlehre

Infektionskrankheiten begleiten die Menschen seit Jahrtausenden. Doch gesicherte Kenntnisse über ihre Ursachen und Entstehung sind noch keine 150 Jahre alt. In der hippokratischen Medizin sah man Veränderungen der Luft als Ursache von epidemisch auftretenden Infektionskrankheiten. Diese Vorstellung führte zur Miasmenlehre (gr. miasma = übler Dunst, Verunreinigung, Ansteckung) zur Erklärung von Seuchen. Zwar vermutete bereits im 16. Jahrhundert der Veroneser Arzt Girolamo Fracastoro „Contagia animata“ (belebte Entzündungsstoffe) als Ursache von Infektionskrankheiten. Und der holländische Amateur Anton van Leeuwenhoek untersuchte mit einem selbst angefertigten Mikroskop das Leben im Wassertropfen und sah dort Bakterien, die er „Animalcules“ (Tierchen) nannte. 1683 be­schrieb er die verschiedenen Mikro­organismen im Zahnbelag. Doch die Miasmenlehre, die sich noch in Begriffen wie Sumpf­fieber und Malaria findet, blieb bis in die zweite Hälfte des 19. Jahrhunderts vorherrschende Lehrmeinung. Als Beginn der medizinischen Bakteriologie gilt gemeinhin der Nachweis durch Robert Koch, dass der Milzbrand, eine übertragbare Krankheit, durch die Besiedlung des Organismus mit einer bestimmten Bakterienspezies entsteht (1876). Doch Koch hatte Vorläufer: Bereits 1841 hatte der Wiener Dermatologe Ferdinand von Hebra den ursächlichen Zusammenhang zwischen der Krätzmilbe und der Krätze gezeigt.

Zur Zeit Leeuwenhoeks ging man von der Urzeugung aus, das heißt der Entstehung von Leben aus toter organischer Materie. Louis Pasteur widerlegte diese Lehre, und Rudolf Virchow etablierte die Zellularpathologie. Das ermöglichte die exakte ätiologische Klärung von Infektionskrankheiten. Zum Ende des 19. Jahrhunderts wurden bei zahlreichen bereits bekannten Krankheiten Mikroorganismen isoliert. Mit den von Koch, Jakob Henle und Friedrich Loeffler erstellten Postulaten („Henle-Koch-Postulate“) ließ sich die ursächliche Rolle dieser Mikroorganismen bei der Entstehung der Infektionskrankheiten beweisen. Sie lauten:

1) Der Erreger muss in jedem Fall anzutreffen sein, und zwar entsprechend den pathologischen Veränderungen und dem klinischen Verlauf der Erkrankung.

2) Der Erreger darf bei anderen Krankheiten nicht als zufälliger, apathogener Keim vorkommen.

3) Mit Reinkulturen des Erregers muss experimentell ein identisches oder ähnliches Krankheitsbild hervorgerufen werden können.

(Fritz Kayser)

Synthetische Herstellung von Farbstoffen

Farbstoffe natürlichen Ursprungs sind seit der Antike bekannt, etwa Purpur aus der Purpurschnecke, das orangegelbe Alizarin aus der Färberkrapppflanze, Henna, Kermes, Kurkuma und Safran. Ab der ersten Hälfte des 19. Jahrhunderts wurden immer mehr organische Farbstoffe synthetisch hergestellt. Den Anfang machte Karl von Reichenbach: 1832 fand er zufällig den ersten dieser Farbstoffe und nannte ihn Pittakall. Zwei Jahre später isolierte Friedlieb Runge aus Steinkohlenteer unter anderem Anilin und Phenol. William Perkin fand 1856 bei Oxidationsversuchen von Anilin das Mauvein – der erste synthetische Farbstoff, der kommerziell produziert wurde. 1861 entdeckte Charles Lauth Kristallviolett, auch Gentianaviolett oder Enzianviolett. Neben seiner Eignung als Färbemittel wirkt es antibakteriell, antimykotisch und antihelminthisch und kam lange Zeit als topisches Antiseptikum zum Einsatz. 1883 wurde es erstmals gezielt hergestellt.

Hans Christian Joachim Gram wurde 1853 als Ältester von sieben Brüdern in Kopenhagen geboren; der Vater war Professor für Jura. Seine Vornamen Hans und Joachim benutzte er nie und nannte sich schlicht Christian Gram. Er interessierte sich für Naturwissenschaften und speziell für Botanik. Seine Kenntnisse auf diesem Gebiet führten ihn zur Pharmakologie, und bald war er im Umgang mit dem Mikroskop sehr geübt. 1873 und ’74 arbeitete er als Assistent des Zoologen Johannes Steenstrup. 1878 bis ’83 studierte er Medizin und wurde mit einer Arbeit über die Größe der roten Blutkörperchen beim Menschen promoviert. In dieser Zeit verbrachte er zwei Wochen im Labor Robert Kochs in Berlin und lernte Färbemethoden für Bakterien, besonders für den Erreger der Tuberkulose, Mycobacterium tuberculosis. Zur Bakteriologie fand Gram durch einen Kurs bei Carl Salomonsen in Kopenhagen. 1883 bis ’85 vertiefte er in Berlin seine Kenntnisse in Bakteriologie und Pharmakologie. Hier kam er mit Karl Friedländer in Kontakt, der seit 1881 die Zeitschrift „Fortschritte der Medizin“ herausgab. 1882 publizierte Friedländer vorab seine Entdeckung des Erregers der Lobärpneumonie. Eine Kontroverse mit Albert Fraenkel über die Ursache der Pneumonie schloss sich an. Zur gleichen Zeit verwendeten Koch und Paul Ehrlich bereits Anilin-Farbstoffe, um Bakterien sichtbar zu machen.

Wie so oft bei großen wissenschaftlichen Entdeckungen fand Gram die nach ihm benannte Färbemethode vermutlich zufällig. Er arbeitete in Friedländers Labor am Berliner Städtischen Krankenhaus und suchte nach einer Färbemethode, mit der Bakterien kontrastierend zu Gewebszellen dargestellt werden konnten. Dabei verschüttete er versehentlich Lugolsche Lösung (nach dem französischen Arzt Jean Guillaume Lugol), eine Jod-Kaliumjodid-Lösung, über den Präparaten aus Lungengewebe. Nachdem er sie mit Alkohol ausgewaschen hatte, bemerkte er, dass das Gewebe entfärbt war. In 19 von 25 Fällen (Mäuse, Meerschweinchen, ein Hund) behielten die Bakterien (Kokken, die die Lobärpneumonie verursachten) jedoch ihre Farbe – es handelte sich also um grampositive Kokken. Gram publizierte seine Entdeckung in Friedländers Zeitschrift („Über die isolirte (sic!) Färbung der Schizomyceten in Schnitt- und Trockenpräparaten“). Am Schluss seines Textes schrieb er: „Mit dieser Methode ist es viel einfacher, die Schizomyceten zu untersuchen. Ich habe sie deshalb ver­öffentlicht, obwohl ich weiß, dass sie noch fehlerhaft und unzureichend ist. Aber es ist zu hoffen, dass sie sich in den Händen anderer Forscher als nützlich erweisen wird.“ „Schizomyceten“ ist ein heute nicht mehr gebräuchlicher Begriff für Bakterien. Friedländer übernahm Grams neue Methode sofort. Grams bescheidener Einschätzung fügte er hinzu: „Hierzu möchte ich mir die Bemerkung erlauben, dass ich die Gramsche Methode als eine ganz ausgezeichnete (...) kennen gelernt habe.“

Unterscheidung der Bakterien

Grams Methode erlaubte zunächst nur den Nachweis grampositiver Bakterien. Hierbei werden im ersten Schritt alle Bakterien mit einer Lösung aus Kristallviolett und Phenol (Karbolsäure) gefärbt. Bei der folgenden Behandlung mit Lugolscher Lösung erscheinen alle Bakterien dunkelblau. Im zweiten Schritt wird mit Ethanol gespült. Hier verhalten grampositive und gramnegative Bakterien sich unterschiedlich: Grampositive Bakterien behalten ihre Farbe, während gramnegative Bakterien schnell wieder entfärbt werden. Um sie sichtbar zu machen, bedarf es einer Gegenfärbung mit Fuchsin oder Safranin. Danach er­scheinen sie rot oder rotorange. Émil Roux verwendete die Methode 1886 zur Differenzierung von grampositiven und gramnegativen Bakterien. Dabei ging es ihm vor allem um die Identifizierung von Gonokokken, die im Unterschied zu vielen anderen Kokken gramnegativ sind.

Warum lassen gramnegative Bakterien sich durch Alkohol rasch wieder entfärben, grampositive jedoch nicht? Der genaue Mechanismus der Farbreaktion ist nicht bekannt; doch das unterschiedliche Verhalten der Bakterien hängt offenbar mit dem Aufbau ihrer Zellwand zusammen. Alle Bakterien besitzen eine solche Zellwand, die ihre zytoplasmatische Membran umgibt. Sie verleiht der Bakterien­zelle Form und Festigkeit und schützt sie gegen osmotische Druck­differenzen zwischen Zellinnerem und äußerem Milieu. Dabei liegt die innerste Schicht der Zellwand der zytoplasmatischen Membran direkt auf. Sie besteht bei allen Bakterien aus einem Polysaccharid-Peptidkomplex (Peptidoglykan), dem Murein (lat. murus = Wand). Es bildet ein netzartiges Riesenmolekül, das wie ein Beutel die gesamte Bakterienzelle umgibt. Bei grampositiven Bakterien macht der Mureinanteil bis zu 50 Prozent der Zellwand aus, bei gramnegativen Bakterien circa 10 Prozent. Nicht alle Bakterienarten können mit der Gram-Färbung klassifiziert werden; neben grampositiven und gramnegativen finden sich auch gramvariable und gramunbestimmte Arten. Eine weitere Differenzialfärbung ist die nach Ziehl-Neelsen (nach Franz Ziehl und Friedrich Neelsen). Sie dient zum Nachweis von Mykobakterien, die sich wegen ihrer lipidreichen Zellwand nicht nach Gram und mit Methylenblau anfärben lassen. Eine Alternative zur Gram-Färbung ist etwa der Aminopeptidasetest. Er beruht darauf, dass sich das Enzym L-Alanin-Aminopeptidase in der Regel nur bei gramnega­tiven Bakterien nachweisen lässt.

Gram vertiefte seine Studien in Straßburg, der Schweiz und Italien; 1885 kehrte er nach Kopenhagen zurück und widmete sich fortan der Inneren Medizin und Pharmakologie. 1889 heiratete er Louise Lohse, die 1900 an Tuberkulose starb. Ab 1891 lehrte Gram an der Kopenhagener Universität Pharmakologie; 1900 wurde er dort Professor. Nach seiner Pensionierung 1923 beschäftigte er sich mit Medizingeschichte sowie Botanik und engagierte sich in der Prävention der Tuberkulose. Für seine Arbeit wurde er vielfach ausgezeichnet. Zeitgenossen beschreiben ihn als herzlichen und hilfsbereiten Menschen von außergewöhnlicher Intelligenz.


Literatur (Auswahl)

1.    Casanova JM: Bacteria and their dyes: Hans Christian Joachim Gram. In: Immunología, Vol. 11, Nr. 4, October–December 1992, 140–50.
2.    Gram HC: Über die isolirte Färbung der Schizomyceten in Schnitt- und Trockenpräparaten. In: Fortschritte der Medicin. Vol. 2, 1884, 185–9.
3.    Hahn H et al. (Ed.): Medizinische Mikrobiologie. Berlin: Springer-Verlag, 1991.
4.    Kayser FH, Bienz KA, Eckert J, Lindenmann J: Medizinische Mikrobiologie. Stuttgart: Georg Thieme Verlag 1986.

 

Entnommen aus MT im Dialog 7/2024

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